Hvad er et rekombinant plasmid?

Et plasmid er et cirkulært stykke DNA, der findes i mange bakterier.Det mest bemærkelsesværdige træk ved plasmider er, at de replikerer uafhængigt af værtens vigtigste DNA.Ofte bruges et plasmid i rekombinant kloningsteknologi til at klone nyligt isolerede gener.Det er også meget almindeligt at bruge et rekombinant plasmid til at udtrykke store mængder af et kendt gen for at opnå RNA eller protein fra det.En sådan rekombinant genekspression har været uundværlig for bioteknologiindustrien.

Rekombinante plasmider blev først udviklet i laboratorierotten i bakterieverdenen, Escherichia coli .Mange andre typer bakterier kan have sådanne plasmider.Disse stykker af selvreplicerende DNA kan overføres naturligt mellem forskellige typer bakterier.På trods af dette var det undertiden vanskeligt at introducere de rekombinante plasmider i andre slags bakterier.

Den primære procedure til introduktion af DNA i andre celler er kendt som transformation, hvor bakterierne behandles med kemikalier, der gør dem mere tilbøjelige til at optage udenlandsk DNA.En anden teknik involverer chokerende bakterierne med en elektrisk strøm.Dette er kendt som elektroporering.

Årsager til at skabe et rekombinant plasmid varierer.Ofte når DNA først isoleres fra et bestemt væv eller organisme, omdannes det til plasmider for at skabe et bibliotek.Derefter kan DNA ekstraheres fra individuelle kolonier.Dernæst kan de screenes ved DNA -sekventering for at bestemme, hvilke typer gener der er til stede, hvis sekvenserne er til stede i en database.Undertiden er gener med ukendte funktioner klonet.

I andre tilfælde er genproduktet velkendt, men forskerne ønsker at udtrykke store mængder af det til videre undersøgelse.Genet kan klones i rekombinante plasmider, der er overekspressionsvektorer.De er specielt designet til at producere store mængder RNA eller protein.Dette har været særlig værdifuldt for rekombinante humane proteiner, som tidligere ofte kun var tilgængelige fra kadavre, hvilket gør det meget vanskeligt at studere funktionen af et bestemt gen.

Flere faktorer er involveret i konstruktion af et plasmid, der kan bruges i molekylær kloning.Plasmidet skal have en valgbar markør.Dette gør det muligt at vælge en celle med genet.Normalt er populationen af celler, der mangler genet med markøren, i høj grad ud af mængden af celler, der bærer det.Generelt har et rekombinant plasmid resistens over for et antibiotikum eller kan vokse i fravær af en bestemt aminosyre.

Et sådant plasmid har brug for en replikationsoprindelse, så det kan begynde at syntetisere dets rekombinante DNA.Derudover kræver et rekombinant plasmid et sæt specielle sekvenser for at give et restriktionsenzym mulighed for at spalte DNA'et for at lade et gen indsættes i kloningsvektoren.Der er et stort antal restriktionsenzymer, der er meget specialiserede til specifikke DNA -sekvenser, der skal være til stede, hvor genet starter og slutter.

Traditionelle bakterierstammer er blevet anvendt til DNA -kloning i årtier.Derudover er der nye sæt, der bruger specielt konstruerede bakteriestammer for at lette overekspression af genproduktet.De kombinerer teknologien til kloning af et gen med en metode, der muliggør let oprensning af proteinet udtrykt fra genet, når det er klonet i det rekombinante plasmid.